100 μg/ml, for Leishmania and T. cruzi, and > to 10 μg/ml for P. falciparum.]]>
Estudios preliminares de los extractos de especies de Cassia y evaluación de la actividad antiparasitaria
Preliminary studied of extras from Cassia species and their antiparitic activity
Boris Espinoza1, Haydee Zainnet2, Grace Ruiz Pinell1, David Gutierrez Yapu1, Alberto Gimenez Turba 1, Ninoska Flores1
1Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. La Paz, Bolivia.
]]> 2Faculty of Pharmacy, University of Szeged, 6720 Szeged, Zrínyi u. 9. Hungary.Dirección para correspondencia: Ninoska Flores Ph D. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. Av. Saavedra N° 2224, 2do Piso, Miraflores. La Paz, Bolivia.
E mail: ninofq@hotmail.com
Recibido para publicación en 31/07/09
Aceptado en 15/10/09
RESUMEN
]]> Las enfermedades parasitarias como las leishmaniasis, la malaria y el mal de Chagas son endémicas en Bolivia y se vuelve una necesidad encontrar productos nuevos con actividad antiparasitaria, menos tóxicos y de bajo costo en Bolivia.En el presente estudio se evaluó la actividad leishmanicida, tripanocida y antiplasmódica de dos especies: Cassia occidentalis y Cassia alata; que en otros trabajos demostraron poseer actividad contra bacterias, hongos y parásitos. Se trabajó con extractos etanólicos de las hojas y raíces, enfrentándolos con tres cepas de Leishmania (L. amazonensis, L brasilensis y L donovani), Tripanozoma cruzi y Plasmodium falciparum. La determinación de la actividad se realizó por el método óptico directo, y se reportaron los resultados en términos de CI50. Los extractos presentaron un CI50 mayor a 100 μg/ml, para Leishmania y T. cruzi, y mayor a 50 μg/ml para P. falciparum, demostrando ser inactivos contra estas cepas.
Palabras Clave. Cassia, Cassia occidentalis, Cassia alata, Leishmania, Plasmodium, Tripanosoma.
ABSTRACT
The parasitic diseases as leishmaniasis, malaria and Chagas are endemic in Bolivia, becomes a necessity to find new products with antiparasitic activity, less toxic and of low cost in Bolivia. In the present studied we reported the leishmanicidal, tripanocidal and antiplasmodial activity of two species of Cassia: Cassia occidentalis and Cassia alata; in other research have been demonstrated biological activity against bacteria, mushrooms and parasites. We studied ethanolic extracts from leaves and roots, and have been tested antiparasitic activity against the promastigote forms of L. amazonensis, L brasilensis and L donovani, Tripanozoma cruzi and Plasmodium falciparum, the determination of the activity was carried out for the direct optic method, and the results were reported in terms of IC50. All the extracts were inactive with IC50 > 100 μg/ml, for Leishmania and T. cruzi, and > to 10 μg/ml for P. falciparum.
Key Words. Cassia, Cassia occidentalis, Cassia alata, Leishmania, Plasmodium, Tripanosoma cruzi.
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades tropicales continúan siendo un problema de salud pública mundial en países que se encuentran en zonas tropicales, como en el caso de regiones amazónicas de Loreto en Perú1, Beni y Pando en Bolivia y en otras regiones de América Latina. Las patologías como la malaria, la enfermedad de Chagas y las leishmaniasis, son enfermedades ligadas a la pobreza y relacionadas con las condiciones higiénico-sanitarias, socio-económicas y ambientales con una considerable morbilidad y mortalidad2.
]]> El elevado costo del tratamiento, los efectos secundarios, la generación de resistencia a los medicamentos circulantes, nos lleva a la necesidad de buscar agentes terapéuticos más económicos, más accesibles, con baja toxicidad y con mayor eficacia para el tratamiento de estas enfermedades3. Un ejemplo de la utilidad de nuestras plantas, es el tratamiento de las leishmaniasis realizado por los pueblos Tacanas4, Chimanes y Mozetenes, utilizando la planta denominada Evanta (Galipea longiflora).Con este conocimiento, y como parte de la búsqueda de nuevos y mejores medicamentos de fácil disponibilidad y baja toxicidad, la OMS dentro del Programa de Enfermedades Tropicales ha considerado la investigación de plantas utilizadas en la medicina tradicional para el tratamiento de enfermedades parasitarias como esenciales y de alta prioridad5.
Las especies vegetales Cassia alata y Cassia occidentalis, son especies que presentan una gran variedad de metabolitos secundarios, tales como taninos, saponinas, alcaloides, flavonoides y antraquinonas6. Además los extractos de sus hojas demostraron tener elevada actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus y Echerichia. coli7 y actividad antifúngica contra Candida albicans en cultivos. También son utilizados en forma de jabones o ungüentos aplicados en infecciones tópicas8,9. La C. occidentalis presentó actividad antiplasmódica inhibiendo el desarrollo de cultivos in vitro de Plasmodium falciparum10.
La presencia de especies de Cassia en Bolivia y los pocos estudios químicos biológicos de las mismas, nos han encaminado a realizar estudios químicos biodirigidos, en la búsqueda de especies con actividad antiparasitaria, centrándonos en la actividad leishmanicida, tripanocida y antiplasmódica. Así, de las plantas recolectadas de C. occidentalis y C. alata, se obtuvieron los extractos etanólicos; posteriormente se realizó la evaluación de la actividad antiparasitaria, sobre cultivos in vitro de Leishmania, Tripanosoma cruzi y Plasmodium falciparum.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Vegetal. Las hojas y raíces de las especies de C. occidentalis (HZ09CO) y C. alata (HZ09CA) fueron recolectadas en la comunidad de Porvenir, Bajo Paraguá, Departamento de Santa Cruz, en octubre de 2008. La recolección e identificación fue realizado por la Lic. Haydee Zainnet. Muestras de herbario han sido depositadas en el Herbario del Oriente Boliviano, Museo de Historia Natural Noel Kempff Mercado, Santa Cruz, Bolivia.
Preparación de los Extractos Etanólicos. Las hojas y raíces de las plantas recolectadas C. occidentalis y C. alata, se separaron y desmenuzaron finamente, para realizar una maceración con etanol al 96%, durante 48 horas a temperatura ambiente. Posteriormente el residuo etanólico se filtró, y se evaporó el disolvente obteniendo el residuo etanólico seco.
Evaluación de la actividad antiparasitaria in vitro. Evaluación de la actividad leishmanicida.. Las formas de promastigotes de Leishmania: L. donovani (cepa PP75), L. brazilensis (cepa M 2903) y L. amazonensis (cepa PH8), fueron cultivada a 26°C en medio Schneider suplementado al 5% con suero bovino fetal inactivo (56°C por 30 minutos). Los parásitos en fase de crecimiento logarítmico fueron distribuidos en una microplaca de 96 pozos a una concentración de 1 x 106 parásitos/ml y cada pozo fue tratado con diferentes concentraciones de los extractos o fracciones durante 72 horas. La actividad se evaluó mediante conteo óptico en microscopio, comparándose con el control positivo y negativo. Pentamidina fue utilizado como fármaco control. Se evaluaron concentraciones de los extractos de 100, 50 y 25 µg/ml; en caso de que los productos presentasen actividad, se disminuyeron las concentraciones hasta obtener la CI50; la prueba se realizó por triplicado11.
Evaluación de la actividad tripanocida. Las formas de epimastigotes de T. cruzi, cepa Tulahuen, fueron cultivadas a 26°C en medio Liver Infusión Tryptose (LIT) suplementado al 5% con suero bovino fetal inactivado (56°C por 30 minutos). Los parásitos en fase de crecimiento logarítmico se distribuyeron en placa de 96 pozos a una concentración de 1x106 parásitos/ml. Cada pozo fue tratado con diferentes concentraciones de los extractos 100, 50 y 25 µg/ml, durante 72 horas. El vehículo utilizado para la disolución de los extractos fue DMSO, en una concentración no superior al 1%. La prueba se realizó por triplicado. La actividad fue medida por conteo óptico con la utilización de un microscopio invertido y comparándose con pozos control. Anfoterecina B fue utilizada como fármaco de referencia11.
En cada modelo experimental la CI50 del extracto fue determinada mediante análisis de regresión lineal (porcentaje de inhibición vs logaritmo de la concentración del extracto).
]]> Evaluación de la actividad antiplamódica in vitro por el Método del Cultivo directo. El método de cultivo continuo in vitro empleado, fue desarrollado en 1976 por Trager y Jensen12. De acuerdo a esta técnica las formas parasitarias de Plasmodium falciparum cepa FCR3 resistente a la cloroquina, fueron cultivadas en medio RPMI 1640 suplementada con suero al 10% y un hematocrito del 4% que se obtuvo añadiendo 200 µl de glóbulos rojos totales (O Rh+) en 4,5 ml de RPMI 1640 suplementado con 0,5 ml de suero o plasma (del mismo tipo de sangre) incubados a 37°C en un medio anaeróbico. Los extractos fueron disueltos en DMSO y la cloroquina en agua para luego ser diluidos con el mismo medio obteniéndose las concentraciones requeridas (0.10, 1 y 10µg/ml). Los cultivos fueron sincronizados de acuerdo al método descrito por Lambros y Vanderberg, en 1979; con una parasitemia y un hematocrito del 1 y 2% respectivamente. Se alícuota un volumen de 100 µl además de 100 µl de los extractos en placas de 96 pozos, e incubados a 37°C por 48 horas. Pasado el tiempo de incubación, se eliminó completamente la fase superior al cultivo, para realizar un frotis del sedimento de cada alveolo, fijando luego con metanol y realizando la tinción con Giemsa. Estas placas fueron observadas al microscopio, con lente de inmersión x 100, contando glóbulos rojos no infectados (GRL) y glóbulos rojos infectados (GRI), para obtener el porcentaje de inhibición:
El cálculo de la Concentración Inhibitoria del 50% en la maduración de los esquizontes (CI50), se realizó por un método gráfico, programa Críquet Graph 1.3, considerándose como activos aquellos que presentaron CI50 menor a 10 µg/ml2,13.
RESULTADOS
Los porcentajes de rendimiento obtenidos del extracto crudo etanólico de hojas y raíces de cada planta, se observan en la Tabla 1.
Tabla 1. Rendimiento de la extracción etanólica de especies de Cassia
Se observó que existe un mayor rendimiento en extracto seco de las hojas de las plantas que de las raíces.
Los extractos de C. occidentalis y C. alata fueron evaluados frente a promastigotes de 3 especies de Leishmania, epimastigotes de Tripanosoma cruzi y Plasmodium falciparum. Los resultados de las actividades de cada extracto se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Actividad antiparasitaria de los extractos etanólicos de C. occidentalis y C. alata
Los extractos etanólicos de hojas y de raíces, de ambas plantas, no presentaron actividad sobre las tres especies parasitarias de Leishmania, sobre los epimastigotes de Tripanosoma cruzi con una CI50 > 100 µg/ml, y tampoco sobre la cepa de Plasmodium falciparum con una CI50 > 10 µg/ml.
]]> DISCUSIÓN
En el presente estudio se trabajaron con extractos etanólicos de hojas y raíces de dos especies de: C. occidentalis y C. alata. Trabajos previos6 de extractos etanólicos de las hojas C. alata, mostraron la presencia de taninos, saponinas, glucósidos y aceites esenciales como estudios preliminares de su composición. También reportaron la existencia de alcaloides, flavonoides y antraquinonas7.
Se tiene referencia de que el extracto acuoso de las hojas de C. alata se reportó inactivo contra P. falciparum, también se tiene que extractos etanólicos de las flores, tallo y hojas de C. occidentalis presentaron un 77% de inhibición frente a P. falciparum10. En este trabajo esta especie no presentó actividad leishmanicida, tripanocida ni antiplasmódica como se hubiera supuesto por los trabajos previos.
Al comparar los resultados de este trabajo con los observados en investigaciones previas, donde se devela la actividad antiplasmódica, debemos hacer algunas consideraciones. Por ejemplo la época de colecta no era la más adecuada, las plantas estudiadas pueden tener diferentes metabolitos a los descritos en la bibliografía, la edad de la planta, pudieron haber sido muy jóvenes o que los metabolitos que contenían la actividad no hubieran sido extraídos de la mejor forma.
Tampoco se puede descartar futuros estudios con los diferentes extractos de estas plantas, puesto que aunque no presenten actividad antiparasitaria, sí se reporta en bibliografía que los extractos etanólicos, metanólicos y acuosos presentan actividad antibacteriana6,7, antifúngica8,9 y antiplasmódica10.
El estudio realizado es preliminar, por lo cual se propone continuar con los trabajos sobre estas plantas, realizando la extracción en otros disolventes (AcOEt, CH2Cl2, Et2O) o también fraccionar el extracto obtenido y realizar la evaluación de cada fracción.
AGRADECIMIENTOS
Al IRD-Francia, por la beca otorgada en la gestión 2008-2009, para la realización de la Maestría en Ciencias Biológicas y Biomédicas de la UMSA; a la Lic. Haydee Zainnet, por realizar la colecta; a la comunidad de Porvenir, Bajo Paraguá, Departamento de Santa Cruz por permitirnos colectar las especies vegetales; al Proyecto PCI-Iberoamérica (A/010794/07, AECI); y al proyecto X.5 “Búsqueda, Obtención y Evaluación de Nuevos Agentes Antiparasitarios” del CYTED (Subprogram X).
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